實(shí)時(shí)熒光定量PCR（一個(gè)極有效的實(shí)驗(yàn)方法）
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實(shí)時(shí)熒光定量PCR
一個(gè)極有效的實(shí)驗(yàn)方法
實(shí)時(shí)熒光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過(guò)內(nèi)參或者外參法對(duì)待測(cè)樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法。
Real-timePCR是在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，通過(guò)熒光信號(hào)，對(duì)PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時(shí)期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以成為定量的依據(jù)。
基本信息
| 中文名 | 實(shí)時(shí)熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng) |
| 外文名 | Real-timeQuantitativepolymerase chain reaction |
| 簡(jiǎn)稱(chēng) | 實(shí)時(shí)熒光定量PCR |
| 外文簡(jiǎn)稱(chēng) | qPCR |
工作原理
所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。
檢測(cè)方法
1.SYBRGreenⅠ法：
在PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR
SYBR定量PCR擴(kuò)增熒光曲線圖
PCR產(chǎn)物熔解曲線圖（單一峰圖表明PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的單一性）
2.TaqMan探針?lè)ǎ?/span>
探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物的形成完全同步。
技術(shù)原理
將標(biāo)記有熒光素的Taqman探針與模板DNA混合后，完成高溫變性，低溫復(fù)性，適溫延伸的熱循環(huán)，并遵守聚合酶鏈反應(yīng)規(guī)律，與模板DNA互補(bǔ)配對(duì)的Taqman探針被切斷，熒光素游離于反應(yīng)體系中，在特定光激發(fā)下發(fā)出熒光，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，被擴(kuò)增的目的基因片段呈指數(shù)規(guī)律增長(zhǎng)，通過(guò)實(shí)時(shí)檢測(cè)與之對(duì)應(yīng)的隨擴(kuò)增而變化熒光信號(hào)強(qiáng)度，求得Ct值，同時(shí)利用數(shù)個(gè)已知模板濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照，即可得出待測(cè)標(biāo)本目的基因的拷貝數(shù)。
Ct 值
Ct值（Cycle threshold，循環(huán)閾值）的含義為：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。
1. 熒光閾值（threshold）的設(shè)定
PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，熒光閾值的缺?。J(rèn)）設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：threshold = 10*SDcycle 3-15
2. Ct值與起始模板的關(guān)系
每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，公式如下。
Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)
n為擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)，X0為初始模板量，Ex為擴(kuò)增效率，N為熒光擴(kuò)增信號(hào)達(dá)到閾值強(qiáng)度時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量。
起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。
熒光化學(xué)物質(zhì)
1. TaqMan熒光探針：PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個(gè)體化用藥分析的首選技術(shù)平臺(tái)。
2. SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，SYBR僅與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合，因此可以通過(guò)溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異。
3.分子信標(biāo)：是一種在5和3末端自身形成一個(gè)8個(gè)堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對(duì)，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊緊靠近，不會(huì)產(chǎn)生熒光。PCR產(chǎn)物生成后，退火過(guò)程中，分子信標(biāo)中間部分與特定DNA序列配對(duì)，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光。
傳統(tǒng)定量PCR
1．傳統(tǒng)定量PCR方法簡(jiǎn)介
（1）內(nèi)參照法：在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不用標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長(zhǎng)度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開(kāi)來(lái)，分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板。
（2）競(jìng)爭(zhēng)法：選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競(jìng)爭(zhēng)性模板。在同一反應(yīng)管中，待測(cè)樣品與競(jìng)爭(zhēng)模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測(cè)模板不被酶切，可通過(guò)電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開(kāi)，分別測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù)。
（3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗地高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的。
2．內(nèi)標(biāo)在傳統(tǒng)定量中的作用
由于傳統(tǒng)定量方法都是終點(diǎn)檢測(cè)，即PCR到達(dá)平臺(tái)期后進(jìn)行檢測(cè)，而PCR經(jīng)過(guò)對(duì)數(shù)期擴(kuò)增到達(dá)平臺(tái)期時(shí)，檢測(cè)重現(xiàn)性極差。同一個(gè)模板在96孔PCR儀上做96次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果有很大差異，因此無(wú)法直接從終點(diǎn)產(chǎn)物量推算出起始模板量。加入內(nèi)標(biāo)后，可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準(zhǔn)確性。但即使如此，傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。
3．內(nèi)標(biāo)對(duì)定量PCR的影響
若在待測(cè)樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標(biāo)，則PCR反應(yīng)變?yōu)殡p重PCR，雙重PCR反應(yīng)中存在兩種模板之間的干擾和競(jìng)爭(zhēng)，尤其當(dāng)兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時(shí)，這種競(jìng)爭(zhēng)會(huì)表現(xiàn)得更為顯著。但由于待測(cè)樣品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以無(wú)法加入合適數(shù)量的已知模板作為內(nèi)標(biāo)。也正是這個(gè)原因，傳統(tǒng)定量方法雖然加入內(nèi)標(biāo)，但仍然只是一種半定量的方法。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定智能能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過(guò)對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無(wú)需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：
（1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。
（2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴(lài)的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR的定量方法
在Real-timePCR中，模板定量有兩種策略，相對(duì)定量和絕對(duì)定量。
相關(guān)應(yīng)用
臨床疾病診斷
各型肝炎、艾滋病、禽流感、結(jié)核、性病等傳染病診斷和療效評(píng)價(jià)；地中海貧血、血友病、性別發(fā)育異常、智力低下綜合癥、胎兒畸形等優(yōu)生優(yōu)育檢測(cè)；腫瘤標(biāo)志物及瘤基因檢測(cè)實(shí)現(xiàn)腫瘤病診斷；遺傳基因檢測(cè)實(shí)現(xiàn)遺傳病診斷。
動(dòng)物疾病檢測(cè)
食源微生物、食品過(guò)敏源、轉(zhuǎn)基因、乳品企業(yè)阪崎腸桿菌等檢測(cè)。
科學(xué)研究
醫(yī)學(xué)、農(nóng)牧、生物相關(guān)分子生物學(xué)定量研究。
應(yīng)用行業(yè)
各級(jí)各類(lèi)醫(yī)療機(jī)構(gòu)、大學(xué)及研究所、CDC、檢驗(yàn)檢疫局、獸醫(yī)站、食品企業(yè)及乳品廠等。
由于qPCR是實(shí)時(shí)定量檢測(cè)致病病原體基因核酸，因此它比化學(xué)發(fā)光、時(shí)間分辨、蛋白芯片等免疫學(xué)方法更具獨(dú)到優(yōu)勢(shì)。
關(guān)于名稱(chēng)
根據(jù)MIQE（Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments）的指導(dǎo)方針，qPCR為Quantitative real-time PCR的簡(jiǎn)稱(chēng)，RT-qPCR指的是Reverse transcription–qPCR，RT-PCR僅用來(lái)表示Reverse transcription polymerase chain reaction，而不是Real-time PCR，但是有少數(shù)作者并沒(méi)有堅(jiān)持這一原則。
檢測(cè)H7N9禽流感的主要方法
2013年春季，中國(guó)內(nèi)地發(fā)生多起H7N9禽流感染人人類(lèi)事件，截至4月6日下午五時(shí)，全國(guó)共報(bào)告18例人類(lèi)感染，6人死亡。針對(duì)此次禽流感事件，對(duì)送檢樣本進(jìn)行H7N9檢測(cè)的方法共有兩種，一種是進(jìn)行核酸檢測(cè)，即采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)H7N9的特異性核酸進(jìn)行檢測(cè)；另一種一種就是對(duì)樣本進(jìn)行H7N9病毒分離鑒定，直接獲取毒株?！昂怂釞z測(cè)快速準(zhǔn)確，是現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室采用的主要檢驗(yàn)方法?！睂?zhuān)家說(shuō)，H7N9特異性核酸檢驗(yàn)耗時(shí)短，從完成樣本處理到最后獲取檢測(cè)結(jié)果，進(jìn)行確診，整個(gè)過(guò)程在3-5個(gè)小時(shí)內(nèi)完成，可實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒的快速診斷。
檢測(cè)過(guò)程分為三個(gè)步驟：對(duì)醫(yī)院采集樣本進(jìn)行標(biāo)本處理，如果發(fā)現(xiàn)可疑病例，將由當(dāng)?shù)蒯t(yī)院專(zhuān)業(yè)的醫(yī)護(hù)人員進(jìn)行采樣，主要提取患者的咽拭子樣本或含漱液、鼻拭子、肺部清洗液的樣本，安全保存后送至實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展病毒檢測(cè)；提取病毒核酸，隨后與H7N9核酸檢測(cè)試劑配成反應(yīng)體系，因?yàn)闄z測(cè)試劑主要針對(duì)H7N9的特異性核酸片段會(huì)起反應(yīng)?？梢哉f(shuō)，通過(guò)這個(gè)試劑能快速確定病人是否感染了H7N9禽流感病毒；放入熒光定量PCR儀做病毒核酸特異擴(kuò)增，進(jìn)行熒光定量檢測(cè)，最后結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)分析，判斷是否呈陽(yáng)性反應(yīng)。
浙江省公共衛(wèi)生檢驗(yàn)檢測(cè)重點(diǎn)學(xué)科群首席專(zhuān)家、應(yīng)急監(jiān)測(cè)關(guān)鍵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任盧亦愚教授，介紹了浙江省自行合成H7N9禽流感檢測(cè)試劑：
“H7N9禽流感檢測(cè)試劑被放置在食指大小的密封透明試管里。每套檢測(cè)試劑由6份EP管組成，包含白色的水滴形小管‘引物’，以及棕色小管‘探針’。引物和探針主要是針對(duì)H7N9特異性核酸片段。目前這些試劑被放在專(zhuān)用試劑盒中，放置在專(zhuān)用冰箱保存?！?/span>
“工作人員需要將檢測(cè)的結(jié)果，結(jié)合實(shí)驗(yàn)時(shí)設(shè)置的陽(yáng)性、陰性對(duì)照進(jìn)行分析，只有陰性、陽(yáng)性結(jié)果成立，且樣本結(jié)果可靠時(shí)才能夠最終確定是否為H7N9禽流感病毒，一般來(lái)說(shuō)，檢測(cè)時(shí)間需3-4個(gè)小時(shí)。”
參考資料
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在線講座：內(nèi)參在real-time PCR病原體檢測(cè)中的應(yīng)用 · 丁香通[引用日期2013-04-07]
[2]
浙江省疾控中心專(zhuān)家回答三大防控焦點(diǎn)問(wèn)題 · 新浪浙江[引用日期2013-04-07]
[3]
熒光定量PCR：簡(jiǎn)介，原理，應(yīng)用 · 丁香通[引用日期2013-04-07]
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尚可名片
這家伙太懶了，什么都沒(méi)寫(xiě)！
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