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亞細(xì)胞定位（某蛋白在細(xì)胞內(nèi)的具體存在部位）

次瀏覽 | 更新時(shí)間：2023-05-22

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亞細(xì)胞定位

某蛋白在細(xì)胞內(nèi)的具體存在部位

亞細(xì)胞定位是指某種蛋白或表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的具體存在部位。例如在核內(nèi)、胞質(zhì)內(nèi)或者細(xì)胞膜上存在。GFP是綠色熒光蛋白，在掃描共聚焦顯微鏡的激光照射下會發(fā)出綠色熒光，從而可以精確地定位蛋白質(zhì)的位置。

基本信息

中文名	亞細(xì)胞定位
外文名	subcellular localization

定義

GFP，實(shí)際是給你要研究的物質(zhì)加上標(biāo)記，在此相當(dāng)于報(bào)告蛋白的作用。使用GFP必須構(gòu)建融合蛋白載體，并在轉(zhuǎn)染之后有效表達(dá)。這樣，若在熒光顯微鏡下看到細(xì)胞內(nèi)某一部位存在GFP信號，說明和GFP融合的蛋白也存在于該部位，這樣就達(dá)到了確定某物質(zhì)亞細(xì)胞定位的目的。

應(yīng)用實(shí)例

基因槍法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞：

分別用70%乙醇和滅菌蒸餾水清洗金粉（直徑為1 μm），加入滅菌蒸餾水制成金粉懸浮液，取100 μL 放在含有1.0 cm2 洋蔥表皮的玻璃皿中，邊振蕩邊加入10 μL pCambia2301-GaMYB2-GFP質(zhì)粒，逐步加入40 μL 0.1 mol·L-1 亞精胺和100 μL2.5 mol·L-1 CaCl2，振蕩混勻。基因槍GDS-80轟擊時(shí)氦氣罐的氣壓為1 300 psi，取10 μL DNA 包裹好的微粒懸浮液加到基因槍中央，進(jìn)行轟擊，之后放置25℃避光過夜培養(yǎng)，使用ConfocalLaser激光共聚焦顯微鏡觀察。

亞細(xì)胞定位

GaMYB2 在洋蔥表皮細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)分析：采用基因槍轟擊的方法，用包裹質(zhì)粒的金粉對洋蔥表皮進(jìn)行轟擊，暗培養(yǎng)過夜后，在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察，從圖A 中可以看出對照GFP空載體在整個(gè)洋蔥細(xì)胞均能看到綠色熒光，為組成型表達(dá)；從圖B 中發(fā)現(xiàn)GaMYB2-GFP 的融合表達(dá)載體只能在細(xì)胞核中能看到綠色熒光，這進(jìn)一步證明該蛋白不具有跨膜蛋白結(jié)構(gòu)，定位在細(xì)胞核中，具有轉(zhuǎn)錄因子的一般特征。

生物信息學(xué)預(yù)測法

不同的細(xì)胞器往往具有不同的理化環(huán)境，它根據(jù)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及表面理化特征，選擇性容納蛋白。

蛋白質(zhì)表面直接暴露于細(xì)胞器環(huán)境中，它由序列折疊過程決定，而后者取決于氨基酸組成。因此可以通過氨基酸組成進(jìn)行亞細(xì)胞定位的生物信息學(xué)預(yù)測。

免疫熒光法

直接法

將標(biāo)記的特異性熒光抗體，直接加在抗原標(biāo)本上，經(jīng)一定的溫度和時(shí)間的染色，用水洗去未參加反應(yīng)的多余熒光抗體，室溫下干燥后封片、鏡檢。

間接法

如檢查未知抗原，先用已知未標(biāo)記的特異抗體（第一抗體）與抗原標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng)，用水洗去未反應(yīng)的抗體，再用標(biāo)記的抗抗體（第二抗體）與抗原標(biāo)本反應(yīng)，使之形成抗體—抗原—抗體復(fù)合物，再用水洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體，干燥、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體，則表明抗原標(biāo)本是已知的，待檢血清為第一抗體，其它步驟的抗原檢查相同。

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