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ATP合成酶
廣泛分布于線粒體內(nèi)膜的蛋白酶
概述
ATP合成酶
組成
ATP合酶主要由F?(伸在膜外的水溶性部分) 和Fo(嵌入膜內(nèi))組成(圖1)。不同物種來源的 ATP合酶含的亞基和數(shù)目不盡相同。以牛心線粒體 ATP合酶為例，它的F?含有僅α3、β3、γ、δ、ε共9 個亞基，F(xiàn)o含a、b2、C10共13個亞基，F(xiàn)?與Fo之間有OSCP柄相連接，還有抑制蛋白。線粒體F?Fo-ATP酶的總分子量約為500 ku。對大腸桿菌ATP合酶的研究較為詳盡，它的F?含5種亞基α、β、γ、δ、ε，分子量分別是55.3、50.3、31.6、19.3和14.9 ku。準量關(guān)系為α3、β3、γ、δ和ε。F?的總分子量為382 ku。Fo由a、b、c 3種亞基組成，分子量分別為30.3、17.2和8.3 ku，準量關(guān)系為a，b2，C9-12。Fo的總分子量約為164 ku，因此大腸桿菌F?Fo一ATP酶的總分子量共為546 ku。葉綠體ATP酶由CF?和CFo兩部分組成，它們的亞基的組成和分子量與上述兩種ATP合酶大體相似，但又有一定的差異。
結(jié)構(gòu)
ATP合酶結(jié)構(gòu)
F1由5個不同的亞基組成，用化學計量法表示是α3β3γ1δε1。通過對牛F1部分的X－Ray晶體衍射分析，得到了一個很確切的結(jié)構(gòu)—α3β3γ集合體。α和β亞基的三個重復結(jié)構(gòu)輪流圍繞在γ亞基α螺旋結(jié)構(gòu)的氨基和羧基末端。此外，重要的是三個β亞基在結(jié)合核苷酸后會處于不同的狀態(tài)：βT,βD和βE。β亞基的不均勻性結(jié)構(gòu)與酶的接觸反應(yīng)部分相比，顯然是一致的。
F0是由三個亞基構(gòu)成，化學計量法表示是a1b2c10-12。c和a亞基的cAsp-61和aArg-210對質(zhì)子遷移分別獨立作用。同時提出了具有12個c亞基的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，并且電子顯微鏡、原子粒顯微鏡也這樣提示，而且單個c亞基的核磁共振形成的模型擁有兩個跨膜α螺旋結(jié)構(gòu)。
描述的是Escherichiacoli的F1F0結(jié)構(gòu)。蛋白是具有兩個方向的。F1部分包括α3，β3，γ，δ和ε亞基，F(xiàn)0部分包含a,b和c亞基，測定其化學含量比為1：2：10－14。F1和F0由兩個細莖連在一起，中心的一條連接γ和ε亞基，外圍的那條則旋繞δ和b亞基。在哺乳動物，通常會有額外的亞基在細莖部位。
合成和水解
ATP合成酶位置
ATP合酶在線粒體內(nèi)膜上的分布不對稱，數(shù)量也不相等。
F1部分包含3個結(jié)合位點，在每一個β亞基上。當少量的ATP增加時，這些結(jié)合位點被占據(jù)，底物結(jié)合的就非常緊密并且ATP的水解發(fā)生得非常緩慢。過量的ATP則導致其可結(jié)合在所有的結(jié)合位點上，并且伴隨產(chǎn)生的是在第二和第三個位點上具有很低的底物親和力。且第三位點的使用率若增加，ATP的水解率則增加104～105。
F1部分是一個有效的三倍復合體，由三個α亞基和β亞基組成，其具有與底物結(jié)合強的負協(xié)調(diào)性質(zhì)，同時亦具有酶活性的正協(xié)調(diào)性質(zhì)。為了解釋這些特殊的部分，Boyer提出“結(jié)合導致變化”或者稱為“抉擇位點”的假想。這則假想的關(guān)鍵特征是三個結(jié)合位點，和因此由三個α和β亞基配對形成的這些位點，在任何時期有不同的信息。一個開放并且準備ATP（或者ADP＋Pi）結(jié)合，而第二和第三個位點則圍繞著一定的核苷酸，部分獨立的開放或者關(guān)閉。ATP結(jié)合物和開放位點關(guān)閉的結(jié)果可以產(chǎn)生協(xié)調(diào)信息的變化，其他的兩個位點也發(fā)生了改變，導致關(guān)閉的位點成為了部分開放，而部分開放的位點成為全部開放。如此，每個位點當ATP水解時，在三個狀態(tài)下發(fā)生變化，在相反的過程中，即當ATP合成時，同樣發(fā)生變化。一些構(gòu)象調(diào)節(jié)的細節(jié)表明三組αβ配對亞基一起同時被調(diào)控，然而對于在每一時期每一位點ATP合成或者分裂過程中，其反應(yīng)的中止仍然有爭議。
電子顯微鏡研究表明在α3β3構(gòu)成的環(huán)中，γ亞基具有旋轉(zhuǎn)性。這在80年代就已經(jīng)證明。這些分析令人信服的顯示了α和β亞基圍繞這個六邊體發(fā)生的改變，六邊體包含一個中心物質(zhì)，這已經(jīng)被認定是γ亞基。
F1部分，化學能促使γ亞基旋轉(zhuǎn)。確切的結(jié)構(gòu)揭示了γ亞基與三個β亞基分別的相互作用。與結(jié)構(gòu)上的特征一致，γ亞基上的突變常常抑制ATP合成/水解，或者影響能量的配對，并且這些突變可受β亞基上的第二個突變抑制。此外，在氨基末端的突變也可受羧基端的突變抑制。類似的，羧基端的突變亦受氨基末端突變的抑制。然而這兩個區(qū)域并不直接的相互作用，所觀察到的現(xiàn)象是長距離抑制現(xiàn)象，這提示在催化過程中，γ亞基的構(gòu)象有一個大的改變。
當β亞基在催化過程中進行一系列構(gòu)象的變化時（βTβDβE）），在α3β的六邊體里，γ亞基也相應(yīng)的改變著構(gòu)象。這種位置的改變最有可能的機制是γ亞基在六邊體里自我的旋轉(zhuǎn)所導致。γ亞基的旋轉(zhuǎn)已經(jīng)由一流的生物化學試驗所提示，包括β/γ亞基的化學交聯(lián)，連接γ亞基的探針漂白后偏震現(xiàn)象的恢復，這些均已發(fā)現(xiàn)。ATP水解時的旋轉(zhuǎn)借助連接嗜溫的桿狀菌γ亞基的肌絲蛋白所記錄。在這個試驗當中，F(xiàn)1通過一個插入β亞基氨基末端的組氨酸標簽固定在玻璃的表面。隨著旋轉(zhuǎn)，扭力發(fā)生，與生理學ATP水解釋放的自由能相比，扭力接近40～50pNnm。因此，αβ3γ復合物是一個將化學能轉(zhuǎn)變?yōu)闄C械能的有效的分子發(fā)動機。
ATP合成過程
F0旋轉(zhuǎn)子的旋轉(zhuǎn)機制：依賴a亞基c環(huán)的活動。與F1相比，ATP合成酶中另一個已經(jīng)很好詮釋的部分是F0，然而在基本的機械模型中，沒有一個能夠解決F0的結(jié)構(gòu)。目前F0結(jié)構(gòu)模型來源于核磁共振中測得的單個c亞基分子的結(jié)構(gòu)，并且同時參考酵母菌F1F0復合物部分X－Ray和原子粒顯微鏡研究數(shù)據(jù)得出模型結(jié)構(gòu)，所有的這些數(shù)據(jù)支持圖1中的環(huán)狀排列。對c亞基和a亞基之間的表面假設(shè)的質(zhì)子通道的研究，采用了突變的研究方法，并且證實c亞基的Asp61和a亞基的Arg210是質(zhì)子轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵氨基酸。
有的人通過實驗發(fā)現(xiàn)來源于細菌的F1F0可以像泵質(zhì)子一樣泵Na＋，簡單的復合物研究發(fā)現(xiàn)當酶激活時，離子在遷移。另外通過致突變研究，去掉Na＋遷移，而Li＋或者H＋保留；現(xiàn)a亞基發(fā)生了一些改變。同時也發(fā)現(xiàn)在這個誘導的突變中，Na＋抑制了ATP的水解，這是因為鈉質(zhì)子通道陽離子的吸引作用。這強有力的證明了F0部分時作為一個單獨的通道而起作用的。
對這個機制的任何細節(jié)上的解釋顯然都需要了解環(huán)上c亞基的數(shù)目，但是對其精確的測量證明是很困難的。總結(jié)以往的實驗數(shù)據(jù)，c亞基的化學計量不同的種屬有不同的數(shù)據(jù)，并且依賴代謝條件，同一個個體都會不同。根據(jù)X－Ray數(shù)據(jù)，酵母菌有10個c亞基。做對照，原子粒顯微鏡發(fā)現(xiàn)P.modestum和葉綠體F0各自有11和14個。
探究及問題
邏輯上很容易設(shè)想固定的部分和旋轉(zhuǎn)的部分可以互換，因為F0F1沒有被固定在膜上。那么F1上固定的亞基如αβ，在旋轉(zhuǎn)子εγс0－12聚集時可以不動。利用與上述相仿的實驗，我們檢驗了這個問題，發(fā)現(xiàn)只要εγс10－12聚集形成一個機械單位，肌絲的旋轉(zhuǎn)就會觀察到。借助遺傳工程，將α亞基和с亞基分別連接生物素標簽和組氨酸標簽，這樣沒有化學能來獲得肌絲蛋白裝配的特殊性。裝配到α亞基的肌絲蛋白能夠在ATP水解時旋轉(zhuǎn)并且產(chǎn)生～40pNnm的扭力。這個現(xiàn)象是表明F0F1是一個旋轉(zhuǎn)酶的另外證據(jù)，并且α和с亞基復合物的旋轉(zhuǎn)是在質(zhì)子轉(zhuǎn)移和ATP水解/合成之間能量耦合的必備特征。
從上述可以看出，ATP合成酶是一個毫微發(fā)電機，它可以將化學能、滲透壓和機械能量互換。另外，還有一個未回答的問題是，γ和с亞基的低聚合物旋轉(zhuǎn)子如何能夠從F1的接觸位點釋放出ATP并且通過F0逆向傳遞質(zhì)子？這需要我們進一步的研究。
前景及展望
面臨的問題
(1)如何獲得Fo的精細結(jié)構(gòu)圖像；
(2)質(zhì)子通道c環(huán)與蛋白a之間的相互作用機制；
(3)質(zhì)子流向與馬達轉(zhuǎn)向的對應(yīng)切換機制；
(4)“轉(zhuǎn)子”γ軸的儲能機制；
(5)“定子”上的化學循環(huán)與“轉(zhuǎn)子”的步進式轉(zhuǎn)動之 問如何實現(xiàn)高效的力學化學耦合；
(6)三個催化位點順序可逆的構(gòu)象變換：βo→←βL，βL→←βT和βT→←βo，與γ近距離的相互作用關(guān)系；
(7)三個催化位點全都結(jié)合核苷才能推動馬達轉(zhuǎn)動 還是只需要其中兩個結(jié)合；
(8)ADP和R與催化位點的結(jié)合和去結(jié)合是順序還是隨機的；
(9)催化位點聚合方向的構(gòu)象變化是否有利于ADP和Pi的結(jié)合，反之。水解方向的構(gòu)象變化是否有利于ATP的結(jié)合等。
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