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酶聯(lián)免疫吸附試驗
吸附試驗
實驗簡介
自從Engvall和Perlman(1971）首次報道建立酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssays,ELISA）以來，由于ELISA具有快速、敏感、簡便、易于標準化等優(yōu)點，使其得到迅速的發(fā)展和廣泛應用。盡管早期的ELISA由于特異性不夠高而妨礙了其在實際中應用的步伐，但隨著方法的不斷改進、材料的不斷更新，尤其是采用基因工程方法制備包被抗原，采用針對某一抗原表位的單克隆抗體進行阻斷ELISA試驗，都大大提高了ELISA的特異性，加之電腦化程度極高的ELISA檢測儀的使用，使ELISA更為簡便實用和標準化，從而使其成為最廣泛應用的檢測方法之一。
特性簡介
用于標記抗體或抗抗體的酶須具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室溫下穩(wěn)定；反應產(chǎn)物易于顯現(xiàn)；能商品化生產(chǎn)。如今應用較多的有辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP應用最廣。
辣根過氧化物酶
過氧化物酶（HRP）廣泛分布于植物中，辣根中含量最高，從辣根中提取的稱辣根過氧化物酶（HRP），是由無色酶蛋白和深棕色的鐵卟啉構成的一種糖蛋白（含糖量18%），分子量約40000，約由300個氨基酸組成，等電點為pH3-9，催化反應的最適pH值因供氫體不同而稍有差異，一般多在pH5左右。此酶溶于水和50%飽和度以下的硫酸銨溶液。酶蛋白和輔基的最大吸收光譜分別為275nm和403nm。
酶的純度以RZ表示：RZ=OD403/OD275
純酶的RZ多在3.0以上，最高為3.4。RZ在0.6以下的酶制品為粗酶，非酶蛋白約占75%，不能用于標記。RZ在2.5以上者方可用于標記。HRP的作用底物為過氧化氫，催化反應時的供氫體有幾種：⑴鄰苯二胺（OPD），產(chǎn)物為橙色，可溶性，敏感性高，最大吸收值在490nm，可用肉眼觀察判別，容易被濃硫酸終止反應，顏色可在數(shù)小時內不改變，是目前國內ELISA中最常用的一種；⑵聯(lián)大茴香胺（OD），產(chǎn)物為橘黃色，最大吸收值在400nm，顏色較穩(wěn)定；⑶5－氨基水楊酸(5－AS）：產(chǎn)物為深棕色，最大吸收值在449nm，部分溶解，敏感性較差；⑷鄰聯(lián)甲苯胺（OT）產(chǎn)物為藍色，最大吸收值在630nm，部分溶解，不穩(wěn)定，不耐酸，但反應快，顏色明顯。
標記方法
良好的酶結合物取決于兩個條件：即高效價的抗體和高活性的酶。抗體的活性和純度對制備標記抗體至關重要，因為特異性免疫反應隨抗體活性和純度的增加而增強。在酶標記過程中，抗體的活性有所降低，故需要純度高、效價高及抗原親和力強的抗體球蛋白，最好使用親和層析提純的抗體，可提高敏感性，而且可稀釋使用，減少非特異性吸附。
酶與抗體交聯(lián)，常用戊二醛法和過碘酸鹽氧化法。郭春祥建立的HRP標記抗體的改良過碘酸鈉法簡單易行，標記效果好，特別適用于實驗室的小批量制備。其標記程序為：將5μgHRP溶于0.5ml蒸餾水中，加入新鮮配制的0.06mol/L的過碘酸鈉（NaIO4）水溶液0.5ml，混勻置4℃冰箱30分鐘，取出加入0.16mol/L的乙二醇水溶液0.5ml，室溫放置30分鐘后加入含5g純化抗體的水溶液1ml，混勻并裝透析袋，以0.05mol/L、pH9.5的碳酸鹽緩沖液于4℃冰箱中慢慢攪拌透析6小時（或過夜）使之結合，然后吸出，加硼氫化鈉（NaBH4）溶液（5(g/ml)0.2ml，置4℃冰箱2小時，將上述結合物混合液加入等體積飽和硫酸銨溶液，置4℃冰箱30分鐘后離心，將所得沉淀物溶于少許0.02mol/L、pH7.4PBS中，并對之透析過夜（4℃），次日離心除去不溶物，即得到酶標抗體，用0.02mol/L、pH7.4PBS稀至5ml，進行測定后，冷凍干燥或低溫保存。
效果測定
測定內容包括酶和抗體活性、結合物中酶含量和IgG含量、酶與IgG摩爾比值以及結合率。
⑴酶與抗體的活性常用瓊脂擴散或免疫電泳法，使抗原與抗體形成沉淀線，經(jīng)PBS漂洗1天，再以蒸餾水浸泡1小時，將瓊脂凝膠片浸于酶底物溶液中著色，如果出現(xiàn)應有的顏色反應，再用生理鹽水浸泡，顏色仍然不褪，表示結合物既有酶的活性，也有抗體活性。良好的結合物在顯色后，瓊擴滴度應在1:16以上。另一個測定方法是用系列稀釋的酶標抗體直接以ELISA方法進行方陣滴定，此法不僅可以測定標記效果，還可以確定酶標抗體的使用濃度。
⑵結合物的定量測定一般是對結合物中的酶和IgG進行定量測定。常用紫外分光光度計于403nm和280nm進行測定，然后按下列公式計算：
酶量（mg/ml）=OD403×0.42
IgG量（mg/ml）=（OD280－OD403×0.4）×0.94×0.62
對于過碘酸鈉氧化法制備的標記抗體量，按下列公式計算：
IgG量（mg/ml）=（OD280－OD403×0.34）×0.62
HRP/IgG摩爾比值=HRP（mg/ml）/IgG（mg/ml）×4
結合物中酶總量=HRP（mg/ml）×結合物溶液量
結合物產(chǎn)率=結合物中酶總量/標記時加入的酶量×100%
用于ELISA的結合物的酶量為400(g/ml時效果一般，為500(g/ml時效果較好，達1000(g/ml時效果最好。mol.比值由于結合物中含的IgG并不完全可靠，所以不能作為主要參數(shù)。一般認為mol.比值為0.7時效果一般，1.0時效果較好，1.5-2.0時最好。酶結合率為7%時效果一般，為9%－10%較好，達30%以上時最好。
ELISA方法的基本類型、用途及操作程序
根據(jù)ELISA所用的固相載體而區(qū)分為三大類型：一是采用聚苯乙烯微量板為載體的ELISA，即我們通常所指的ELISA（微量板ELISA）；另一類是用硝酸纖維膜為載體的ELISA，稱為斑點ELISA（Dot-ELISA）；再一類是采用疏水性聚脂布作為載體的ELISA，稱為布ELISA（C－ELISA）。在微量板ELISA中，又根據(jù)其性質不同分為間接ELISA、雙抗體夾心ELISA、雙夾心ELISA、競爭ELISA、阻斷ELISA及抗體捕捉ELISA。
間接ELISA
本法主要用于檢測抗體。以鴨病毒性肝炎（DVH）抗體的ELISA為例，間接ELISA的操作程序如下。
⑴材料
③ELISA檢測儀、加樣器、聚苯乙烯微量板。
⑵方法步驟
①加抗原包被→4℃過夜，洗滌三次、拋干
②加待檢血清→37℃2小時，洗滌三次、拋干
③加酶標抗體→37℃2小時，洗滌三次、拋干
④加底物液→37℃30分鐘，加終止液
⑤用ELISA檢測儀測定OD值，并計算出P/N比值。
⑶結果判定已知陽性血清與已知陰性血清的比值（P/N）≥2.1，而且已知陽性血清的OD值≥0.4；在上述條件成立的情況下，如果待檢血清與已知陰性血清的比值（P/N）≥2.1，而且待檢血清的OD值≥0.4，則判為陽性，否則判為陰性。
雙抗體夾心
本法主要用于檢測大分子抗原。現(xiàn)以檢測雞傳染性法氏囊病病毒（IBDV）的雙夾心抗體ELISA為例介紹本法的操作程序。
①加抗體包被→4℃過夜，洗滌三次、拋干
②加待檢抗原→37℃30分鐘，洗滌三次、拋干
③加酶標抗體→37℃30分鐘，洗滌三次、拋干
④加底物液→37℃15分鐘，加終止液
⑤用ELISA檢測儀測定OD值。
雙夾心ELISA
此法與雙抗體夾心ELISA的主要區(qū)別在于：它是采用酶標抗抗體檢查多種大分子抗原，它不僅不必標記每一種抗體，還可提高試驗的敏感性。此法的基本程序為：
①加抗體（Ab-1）包被→4℃過夜，洗滌三次、拋干
②加待檢抗原（Ag）→37℃60分鐘，洗滌三次、拋干
③加用非同種動物生產(chǎn)的特異性抗體（Ab-2)→37℃60分鐘，洗滌三次、拋干
④加入酶標抗Ab-2抗體（AB-3）→37℃60分鐘，洗滌三次、拋干
⑤加底物液→37℃20分鐘，加終止液
⑥用ELISA檢測儀測定OD值。
競爭ELISA
①抗體包被→4℃過夜，洗滌三次、拋干
②加入待檢抗原及一定量的酶標抗原（對照孔僅加酶標抗原）→37℃60分鐘，洗滌三次、拋干
③加底物液→37℃20分鐘，加終止液
④用ELISA檢測儀測定OD值。
被結合的酶標抗原的量由酶催化底物反應產(chǎn)生有色產(chǎn)物的量來確定，如果待檢溶液中抗原越多，被結合的標記抗原的量就越少，有色產(chǎn)物就減少，這樣根據(jù)有色產(chǎn)物的變化就可求出未知抗原的量。此法的優(yōu)點在于快速、特異性高、且可用于小分子抗原及半抗原的檢測；其主要不足在于每種抗原都要進行酶標記，而且因為抗原的結構不同，還需應用不同的結合方法。此外，試驗中應用酶標抗原的量較多。
阻斷ELISA
本法主要用于檢測型特異性抗體。該方法現(xiàn)已成為豬傳染性胃腸炎（TGE）、豬偽狂犬病（PR）及豬胸膜肺炎（AP）的主要檢測方法。下面以AP2型抗體的阻斷ELISA檢測法為例介紹其操作程序：
①100μlAP2型工作量抗原包被→4℃過夜，洗滌三次、拋干
③加工作量1:4稀釋被檢豬血清100μl→37℃60分鐘，洗滌三次、拋干
④加100μl工作量兔抗AP2型血清→37℃30分鐘，洗滌三次、拋干
⑤加100μl工作量豬抗兔IgG-HRP→37℃60分鐘，洗滌三次、拋干
⑥加100μlOPD底物液→37℃20分鐘，加終止液
⑦用ELISA檢測儀測定OD值。
本試驗同時設標準陰、陽性血清對照、兔抗AP2型陽性對照、空白對照。
抗體捕捉ELISA
本法主要用于檢測IgM抗體。由于IgM抗體出現(xiàn)于感染早期，所以檢測出IgM，則可作為某種疾病的早期診斷。抗體捕捉ELISA根據(jù)所用標記方式不同可分為標記抗原、標記抗體、標記抗抗體捕捉ELISA等幾種，其中以標記抗原捕捉ELISA比較有代表性，該方法的主要程序為：
①用抗u鏈（抗IgM重鏈）抗體包被→37℃60分鐘后置4℃過夜，洗滌三次、拋干
②加待檢血清→37℃2小時，洗滌三次、拋干
③加酶標抗原→37℃60分鐘，洗滌三次、拋干
④加底物液→37℃20分鐘，加終止液
⑤用ELISA檢測儀測定OD值。
斑點ELISA
與常規(guī)的微量板ELISA比較，Dot-ELISA具有簡便、節(jié)省抗原等優(yōu)點，而且結果可長期保存；但其也有不足，主要是在結果判定上比較主觀，特異性不夠高等。該方法的主要操作程序為：
⑴載體膜的預處理及抗原包被取硝酸纖維素膜用蒸餾水浸泡后，稍加干燥進行壓圈。將陰性、陽性抗原及被檢測抗原適度稀釋后加入圈中，置37℃使硝酸纖維素膜徹底干燥。每張7cm×2.3cm的膜一般可點加40－53個樣品，每個壓圈可加抗原液1－20μl。
⑵封閉將硝酸纖維素膜置于封閉液中，37℃感作15－30分鐘。封閉液多采用含有正常動物血清、pH7.2或pH7.4的PBS。
⑷加酶標抗體，37℃反應一定時間后，用洗滌液洗三次。
⑸顯色加入新鮮配制的底物液，37℃反應一定時間后，去掉底物液，加蒸餾水洗滌終止反應。
布ELISA
（C－ELISA）C－ELISA（Cloth-ELISA）是加拿大學者Blais,B.W.等于1989年建立的一種新型免疫檢測技術。該方法是以疏水性聚脂布（HydrophobicPolyesterCloth）即滌綸布為固相載體，這種大孔徑的的疏水布具有吸附樣品量大，可為免疫反應提供較大的表面積，提高反應的敏感性，且容易洗滌，不需特殊儀器等優(yōu)點。其基本原理與Dot-ELISA類似，只是載體不同。以對布氏桿菌抗原的檢測為例，C－ELISA的主要程序為：
⑵加被檢樣品并于室溫下感作30分鐘，然后洗5次；
⑶加酶標記的抗布氏桿菌抗體，于室溫下感作30分鐘，然后洗滌5次；
⑷加入底物液顯色；
⑸測定OD值。
影響因素
素質因素
實驗室人員的素質主要包括五個方面：思想素質、文化素質、技術素質、心理素質、身體素質。首先應具備一個良好的思想素質，因為我們的服務對象是人，我們的道德水平直接關系到人們的健康和生命安危，如果馬馬虎虎。三心二意，難免會有差錯事故發(fā)生，我們應該熱愛專業(yè)，耐心細致。在工作中如標本混淆、張冠李戴、報告單發(fā)錯等都有可能造成嚴重后果；其次文化素質和技術素質，我們要熟練掌握本專業(yè)的基本理論和基本技術，認真學習新理論新知識，努力提高自己的業(yè)務水平，創(chuàng)造一個能夠勝任本職工作的技術平臺。良好的心理素質就是要勇于面對工作生活中的挫折，在繁忙工作中，有條不紊，冷靜沉著的處理有關事務。人員素質問題是影響檢驗結果的首要因素。
標本處理因素
實驗室人員收到標本后應認真查對，對不符合要求的標本和申請單要拘收，合格標本要及時分離血清，避免溶血，提取血清時不應混有大量纖維蛋白或細胞成分。對不能及時檢測的標本要妥善保存于4℃冰箱，做好原始記錄，標本管上最好標上待檢者姓名、日期。從冰箱取出的標本要預溫至室溫，對冰凍的樣品要融化好，并充分混勻再用。
注意事項
1、操作前應對實驗的物理參數(shù)有充分的了解，如環(huán)境溫度(保持在18C～25℃)、反應孵育溫度和孵育時間、洗滌的次數(shù)等，要先查看水育箱溫度，是否符合要求。
2、正確使用加樣器加樣器應垂直加入標本或試劑，避免刮擦包被板底部。加樣過程中避免液體外濺，血清殘留在反應孔壁上，加樣器吸頭要清洗干凈，避免污染，加樣次序要與說明書一致，否則可導致結果錯誤，實驗重復性差。
3、手工洗板加洗液時沖擊力不要太大，洗滌次數(shù)不要超過說明書推薦的洗滌次數(shù)，洗液在反應孔內滯留的時間不宜太長。不要使洗液在孔間竄流，造成孔問污染，導致假陰性或假陽性。
5、顯色液量不可過多加樣的工作環(huán)境不能處于陽光直射的環(huán)境下，加顯色系統(tǒng)后要避光反應，顯色液量不能過多，以免顯色過強。
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這家伙太懶了，什么都沒寫！
作者
