精選百科
本文由作者推薦
外顯子捕獲
外顯子捕獲
外顯子捕獲(exon trapping) 是構(gòu)建一種載體，從其插入片段中識別和回收外顯子序列，從而克隆目的基因。捕獲外顯子的載體pETV—SD是一種反轉(zhuǎn)錄病毒穿梭載體，即可在不同種生物中如大腸桿菌和酵母，細(xì)菌和哺乳動物細(xì)胞等進(jìn)行復(fù)制的載體因為凡是有內(nèi)含子和外顯子的基因在轉(zhuǎn)錄后都要經(jīng)過RNA剪接，這就需要有剪接供體(splicing donor，SD)位點和剪接受體(splicing acceptor，SA)位點。因此，SA位點可作為基因的標(biāo)志。pETV—咀載體的克隆位點上游有一個“外顯子捕獲序列”(exon trap cassette)，可用來識別載體的插入片段中有無SA位點。
基本信息
| 中文名 | 外顯子捕獲 |
| 外文名 | exon trapping |
| 方法 | 構(gòu)建一種載體 |
| 目的 | 克隆目的基因 |
操作步驟
(1)基因組DNA經(jīng)“霰彈法”切成小片段后，克隆在位于“外顯子捕獲序列”下游的克隆位點上。
(2)將這些重組載體匯總后感染反轉(zhuǎn)錄病毒的專宿包裝細(xì)胞系(ecotropicretroviral packaging cell line)——ψ2細(xì)胞系。ψ2細(xì)胞提供蛋白質(zhì)產(chǎn)物使載體(自身不能合成病毒蛋白質(zhì))成為反轉(zhuǎn)錄病毒在細(xì)胞里增殖。當(dāng)反轉(zhuǎn)錄病毒在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄時，如果插入片段中包含有功能的SA位點，則有可能發(fā)生RNA剪接反應(yīng)而將IVS切除。
(3)已剪接和未剪接的病毒RNA都包裝在病毒子(virion)中，從細(xì)胞培養(yǎng)液中收集后用來感染兼宿反轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞系(amphotropic retroviral packagingcell line)PA-317。這使反轉(zhuǎn)錄病毒再進(jìn)行一輪復(fù)制，并產(chǎn)生能感染猴腎細(xì)胞系COS細(xì)胞的高效價病毒原種。這樣做是由于上一輪克隆在病毒中的插入片段的剪接效率極低，而在第二輪復(fù)制時則大大提高了RNA剪接的機會。
(4)從第二個細(xì)胞系PA-317細(xì)胞中分離得到的病毒，用來感染組成型產(chǎn)生SV40T(腫瘤)抗原的COS細(xì)胞。病毒RNA基因組被反轉(zhuǎn)錄，并在載體上的SV40復(fù)制起點作用下，以環(huán)狀DNA附加體形式進(jìn)行復(fù)制。
基本原理
(5)從COS細(xì)胞中回收復(fù)制的附加體DNA，經(jīng)限制性內(nèi)切酶Dpn I 酶切后轉(zhuǎn)化細(xì)菌。在含卡那霉素(Kn)和5—氯—4—溴—3—吲哚—β—D—半乳糖苷(X-gal)的培養(yǎng)基上挑選轉(zhuǎn)化子。盧—半乳糖苷酶可水解X—gal而生成藍(lán)色產(chǎn)物。因此，不產(chǎn)生β—半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)化子菌落則呈白色。
(6)只挑選出白色菌落作進(jìn)一步研究的材料。白色菌落的生成可以有二種原因。一是由于基因發(fā)生突變，使夕—半乳糖苷酶失去活性；二是由于在反轉(zhuǎn)錄病毒生活周期的RNA時期中發(fā)生了剪接反應(yīng)，從而丟失了α,β—半乳糖苷酶基因。
(8)如果是真正發(fā)生了RNA剪接事件，準(zhǔn)確的剪接反應(yīng)可切除作為標(biāo)記的IVS，使人口—珠蛋白基因的第1外顯子與落入了捕獲陷阱的插入片段中的外顯子序列連接，這可直接測定其序列加以證明。
外顯子捕獲相關(guān)的文章
鼻炎是一種常見的鼻腔黏膜炎癥性疾病。多發(fā)生于春夏交替的季節(jié)，我國發(fā)病率呈上升的趨勢。病因較為復(fù)雜，與多種因素有關(guān)，病毒感染是首要原因。主要表現(xiàn)為鼻塞、鼻癢、打噴嚏、流鼻涕、嗅覺下降、頭痛、頭昏等。主要通過藥物治療來緩解癥狀，此外還會有變應(yīng)原特異性免疫治療、手術(shù)治療等。如未及時治療，可能會引起急性鼻竇
伯父是漢語中對父親的哥哥的稱呼，也可以指大伯子，即丈夫的哥哥。在英文中，伯父與叔父、舅父等統(tǒng)稱為Uncle。伯父妻子則稱為「伯姆」、「伯娘」或「伯母」。此外，「伯父」、「伯伯」、「阿伯」也可以作為對比自己父親年紀(jì)大的男性長輩的尊稱，如「世伯」。同時，「伯伯」、「阿伯」也是對一般中老年男性的稱呼。
西晉（公元265年—公元316年）是中國歷史上三國時期之后的大一統(tǒng)王朝之一，另與東晉合稱晉朝。傳四帝，國祚五十一年。若以滅東吳始，則僅立朝37年。為了區(qū)別于東晉，史稱西晉，兩晉又被稱為司馬晉。
尚可名片
這家伙太懶了，什么都沒寫！
作者
