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瓊脂糖
線性的多聚物
基本信息
| 中文名 | 瓊脂糖 |
| 外文名 | Agarose |
| 別名 | 瓊膠素、瓊膠糖 |
| 化學(xué)式 | C24H38O19 |
| 外觀 | 白色或黃色珠狀凝膠顆粒或粉末 |
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概述
瓊脂糖
來源于紅藻的多糖，其主要成分為多聚半乳糖，其中約70%為瓊脂糖，30%為支鏈瓊脂糖。瓊脂糖具線型結(jié)構(gòu)，由D-半乳糖和3,6-脫水半乳糖通過β-1，4和α-1，3連接交替形成重復(fù)雙糖單位。支鏈瓊脂糖則從β-1，3鍵分出另一鏈。用熱水從海藻抽提的物質(zhì)約含40%瓊脂。市售的瓊脂（俗稱洋菜）常呈片狀或疏松繩索狀，通常作食用膠質(zhì)，藥物包裝劑或細菌培養(yǎng)基使用。純制的瓊脂糖常在生物化學(xué)實驗室中，作為電泳、層析等技術(shù)中的半固體支持物，用于生物大分子或小分子物質(zhì)的分離和分析。
瓊脂，它的英文名為agar。這個詞來源于馬來語的agar-agar，意思是膠狀物。又名瓊膠、菜燕、凍粉，是一類從石花菜及其它紅藻類（Rhodophyceae）植物提取出來的藻膠（phycocottoid），在我國及日本已有三百多年（1658年）的歷史。中國人亦稱為洋菜或凍粉。日本人稱之為寒天（kanten），因為它在冬天收獲。臺灣人叫它菜燕，和燕窩的質(zhì)感差不多。韓國人的叫法是??（不知道啥意思）。
計算化學(xué)數(shù)據(jù)
1.疏水參數(shù)計算參考值（XlogP）:無
2.氫鍵供體數(shù)量:0
3.氫鍵受體數(shù)量:1
4.可旋轉(zhuǎn)化學(xué)鍵數(shù)量:6
5.互變異構(gòu)體數(shù)量:7
6.拓撲分子極性表面積17.1
7.重原子數(shù)量:15
8.表面電荷:0
9.復(fù)雜度:178
10.同位素原子數(shù)量:0
11.確定原子立構(gòu)中心數(shù)量:0
12.不確定原子立構(gòu)中心數(shù)量:0
13.確定化學(xué)鍵立構(gòu)中心數(shù)量:0
14.不確定化學(xué)鍵立構(gòu)中心數(shù)量:0
15.共價鍵單元數(shù)量:1
物化信息
中文名稱：瓊脂糖
中文別名：瓊脂糖ME
英文名稱:Agarose
英文別名:Agarose, medium EEO, Molecular Biology Grade; agarose, mixture; Agaroseforelectrophoresisofmacromolecules;agarose for molecular biology; agarose 6 B for chromatography; Agarose LE; sepharose(R) 4B for chromatography;
CAS:9012-36-6;62610-50-8
EINECS:232-731-8
分子式:C24H38O19
分子量:630.5471
安全術(shù)語:S24/25:Avoid contact with skin and eyes.;
物化性質(zhì)
熔點:260-481.5℃
相對密度:1.81g/cm3
凝膠性能
瓊脂糖
1937年荒木第一次從瓊脂中分離出瓊脂糖，但直到1961年Hjertin首先發(fā)現(xiàn)了瓊脂糖優(yōu)異的使用性能后才引起了越來越多的關(guān)注，并開始工業(yè)生產(chǎn)。瓊脂糖廣泛應(yīng)用于臨床化驗、生化分析和生物大分子物質(zhì)的分離等領(lǐng)域。
用途
瓊脂、瓊脂糖因為有特殊的膠凝性質(zhì)，尤其有顯著的穩(wěn)固性、滯度和滯后性，并且易吸收水分，有特殊的穩(wěn)定效應(yīng)；已經(jīng)廣泛使用于食用、醫(yī)藥、化工、紡織、國防等領(lǐng)域，據(jù)不完全統(tǒng)計，瓊脂、瓊脂糖的用途已有1000多種，被國際上稱為“新奇的東亞產(chǎn)品”。在食品工業(yè)中可用于生產(chǎn)：水晶軟糖、定型軟糖、水產(chǎn)品、肉類罐頭、果汁飲料、果肉飲料、米酒飲料、乳品飲料、精品、乳品蛋糕。
由于其良好的生物相容性又廣泛用于生物分離介質(zhì)的生產(chǎn)。
簡單地說，把瓊脂中的瓊脂果膠去掉，剩下的部分，就是瓊脂糖。
電泳技術(shù)
特點
天然瓊脂（agar）是一種多聚糖，主要由瓊脂糖（agarose，約占80%）及瓊脂膠（agaropectin）組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷，而瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強酸性多糖，由于這些基團帶有電荷，在電場作用下能產(chǎn)生較強的電滲現(xiàn)象，加之硫酸根可與某些蛋白質(zhì)作用而影響電泳速度及分離效果。因此，目前多用瓊脂糖為電泳支持物進行平板電泳，其優(yōu)點如下。
（3）瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結(jié)果可直接用紫外光燈檢測及定量測定。
（4）電泳后區(qū)帶易染色，樣品極易洗脫，便于定量測定。制成干膜可長期保存。
目前，常用瓊脂糖作為電泳支持物，分離蛋白質(zhì)和同工酶。將瓊脂糖電泳與免疫化學(xué)相結(jié)合，發(fā)展成免疫電泳技術(shù)，能鑒別其他方法不能鑒別的復(fù)雜體系，由于建立了超微量技術(shù)，0.1ug蛋白質(zhì)就可檢出。
瓊脂糖凝膠電泳也常用于分離、鑒定核酸，如DNA鑒定，DNA限制性內(nèi)切核酸酶圖譜制作等。由于這種方法操作方便，設(shè)備簡單，需樣品量少，分辨能力高，已成為基因工程研究中常用實驗方法之一。
DNA電泳
瓊脂糖凝膠電泳對核酸的分離作用主要是依據(jù)它們的相對分子量質(zhì)量及分子構(gòu)型，同時與凝膠的濃度也有密切關(guān)系。
1．核酸分子大小與瓊脂糖濃度的關(guān)系
（1）DNA分子的大小 在凝膠中，DNA片段遷移距離（遷移率）與堿基對的對數(shù)成反比，因此通過已知大小的標(biāo)準(zhǔn)物移動的距離與未知片段的移動距離時行比較，便可測出未知片段的大小。但是當(dāng)DNA分子大小超過20kb時，普通瓊脂糖凝膠就很難將它們分開。此時電泳的遷移率不再依賴于分子大小，因此，就用瓊脂糖凝膠電泳分離DNA時，分子大小不宜超過此值。
（2）瓊脂脂糖的濃度 如下表所示，不同大小的DNA需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳分離。
表 瓊脂糖濃度與DNA分離范圍
瓊脂糖濃度 /% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
線狀DNA大小/kb60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1
2．核酸構(gòu)型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系
不同構(gòu)型DNA的移動速度次序為：供價閉環(huán) DNA（covalently closed circular，cccDNA）>直線DNA>開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA。當(dāng)瓊脂糖濃度太高時，環(huán)狀DNA（一般為球形）不能進入膠中，相對遷移率為0（Rm=0），而同等大小的直線雙鏈DNA（剛性棒狀）則可以長軸方向前進（Rm>0），由此可見，這三種構(gòu)型的相對遷移率主要取決于凝膠濃度，但同時，也受到電流強度、緩沖液離子強度等的影響。
3．電泳方法
（1）凝膠類型
用于分離核酸的瓊脂糖凝膠電泳可分為垂直型及水平型（平板型）。水平型電泳時，凝膠板完全浸泡在電極緩沖液下1-2mm，故又稱為潛水式。目前更多用的是后者，因為它制膠和加樣比較方便，電泳槽簡單，易于制作，又可以根據(jù)需要制備不同規(guī)格的凝膠板，節(jié)約凝膠，因而較受歡迎。
（2）緩沖液系統(tǒng)
缺少離子時，電流太小，DNA遷移慢；相反，高離子強度的緩沖液由于電流太大會大量產(chǎn)熱，嚴(yán)重時，會造成膠熔化和DNA的變性。
常用的電泳緩沖液有EDTA（pH8.0）和Tris-乙酸（TAE），Tris-硼酸（TBE）或Tris-磷酸（TPE）等，濃度約為50mmol/L(pH7.5~7.8)。電泳緩沖液一般都配制成濃的貯備液，臨用時稀釋到所需倍數(shù)。
TAE緩沖能力較低，后兩者有足夠高的緩沖能力，因此更常用。TBE濃溶液長期貯存會出現(xiàn)沉淀，為避免此缺點，室溫下貯存5×溶液，用時稀釋10倍0.5×工作溶液即能提供足夠緩沖能力。
（3）凝膠的制備
（4）樣品配制與加樣
DNA 樣品用適量Tris-EDTA緩沖液溶解，緩沖液內(nèi)含有0.25%溴酚藍或其他指示染料，含有10%-15%蔗糖或5%~10%甘油，以增加其比重，使樣品集中。為避免蔗糖或甘油可能使電泳結(jié)果產(chǎn)生U形條帶，可改用2.5%Ficoll（聚蔗糖）代替蔗糖或甘油。
（5）電泳
瓊脂糖凝膠分離大分子DNA實驗條件的研究結(jié)果表明，在低濃度、低電壓下，分離效果較好。在低電壓條件下，線性DNA分子的電泳遷移率與所用的電壓呈正比。但是，在電場強度增加時，較大的DNA片段遷移率的增加相對較小。因此隨著電壓的增高，電泳分辨率反而下降，為了獲得電泳分離DNA片段的最大分辨率，電場強度不宜高于5V/cm。
電泳系統(tǒng)的溫度對于DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳行為沒有顯著的影響。通常在室溫下進行電泳，只有當(dāng)凝膠濃度低于0.5%時，為增加凝膠硬度，可在4℃進行電泳。
（6）染色和拍照
轉(zhuǎn)移電泳
生物化學(xué)與分子生物學(xué)的研究工作經(jīng)常需要對電泳分離后的DNA進行分子雜交，但瓊脂糖不適合于進行雜交操作，1975年，Southren創(chuàng)造了將DNA區(qū)帶原位轉(zhuǎn)移到硝酸基纖維素膜（NC膜）上，再進行雜交的方法，被稱為Southren印跡法。隨后，Alwine等將類似方法用于RNA印跡，被戲稱為Northern印跡，1979年Towbin等設(shè)計了將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜的裝置，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，再與相應(yīng)的抗體等配體反應(yīng)，被戲稱為Western印跡，這種裝置將膜和凝膠、濾紙等制成夾心餅干狀，用低電壓高電流電泳完成轉(zhuǎn)移。1982年Reinhart等用電轉(zhuǎn)移法將等電聚焦后的蛋白質(zhì)區(qū)帶從凝膠轉(zhuǎn)移到特定膜上，稱Eastern印跡。
目前國內(nèi)外有多種核酸、蛋白質(zhì)印跡轉(zhuǎn)移的電泳裝置出售，使印跡轉(zhuǎn)移速度快效率高、重復(fù)性好，應(yīng)用更加廣泛。聚丙烯酰胺凝膠也可用于印跡轉(zhuǎn)移電泳，但轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)時，凝膠中不可含有SDS、尿素等變性劑。用于轉(zhuǎn)移電泳的支持膜亦有多種選擇，近些年用尼龍膜較多，因為尼龍膜機械性能好，烘烤不變脆，使用時比硝酸纖維素膜更方便。
進行印跡轉(zhuǎn)移電泳時，要注意緩沖液的離子強度要低，pH要遠離pI，使蛋白質(zhì)帶有較多電荷，一般用穩(wěn)定性較好的Tris-緩沖體系。還要注意凝膠與支持膜之間有能有氣泡。適當(dāng)提高電壓或電流可以提高轉(zhuǎn)移速度，但亦會增加熱效應(yīng)，故電壓或電流不可過高。
凝膠電泳
一般瓊脂糖凝膠電泳只能分離小于20kb的DNA。這是因為在瓊脂糖凝膠中，DNA分子的有效直徑超過凝膠孔徑時，在電場作用下，迫使DNA變形擠過篩孔，而沿著泳動方向伸直，因而分子大小對遷移率影響不大。如此時改變電場方向，則DNA分子必須改變其構(gòu)象，沿新的泳動方面伸直，而轉(zhuǎn)向時間與DNA分子大小關(guān)系極為密切。1983年Schwartz等人根據(jù)DNA分子彈性弛豫時間（外推為0的滯留時間）與DNA分子大小有關(guān)的特性，設(shè)計了脈沖電場梯度凝膠，交替采用兩個垂直方向的不均勻電場，使DNA分子在凝膠中不斷改變方向，從而使DNA按分子大小分開。后來Carle等改進了電泳技術(shù)，并發(fā)現(xiàn)周期性的反轉(zhuǎn)換電場(periodic inversion of the electric field)亦能使大分子DNA通過電泳分開。電泳系統(tǒng)是由一水平式電泳槽和兩組獨立、彼此垂直的電極組成，一組電極負極為N，正極為S；另一組負極為W，正極為E。一塊正方形瓊脂糖凝膠板（10cm*10cm或20cm*20cm）呈45度放中央。電場在N-S和W-E之間交替建立。電場交替改變的時間長短與欲分離的DNA分子大小有關(guān)。
電泳時，DNA分子處在連續(xù)間隔交替的電場中。首先向S極移動，然后改向E極。在每次電場方向改變時，DNA分子就要有一定的時間松弛，改變形狀和遷移方向。只有當(dāng)DNA分子達到一定構(gòu)型后，才能繼續(xù)前時。DNA分子凈移動方向與加樣線垂直，使樣品中各組分沿同一泳道形成各自的區(qū)帶。交變脈沖電泳可有效分離數(shù)百萬堿基對的大分子DNA。較新式的儀器電極間的角度和脈沖時間均可調(diào)，使用更加方便。
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